Tutorial Inicial de Piximi (ESPAÑOL)

Segmentación y clasificación sin instalación en el navegador

Beth Cimini, Le Liu, Esteban Miglietta, Paula Llanos, Nodar Gogoberidze

Instituto Broad del MIT y Harvard, Cambridge, MA.

Información general:

¿Qué es Piximi?

Piximi es una herramienta moderna de análisis de imágenes que toma ventaja de varios métodos de deep learning, sin requerir conocimientos de programación. Implementado como una aplicación web en https://piximi.app/, Piximi no requiere instalación y se puede acceder a ella desde cualquier navegador web moderno. Su arquitectura de cliente único preserva la seguridad de los datos del investigador ejecutando todos los cálculos localmente.

Piximi es interoperable con herramientas y flujos de trabajo existentes, ya que admite la importación y exportación de formatos de datos y modelos comunes. La interfaz intuitiva y el fácil acceso a Piximi permiten a los biólogos obtener información sobre las imágenes en tan sólo unos minutos. Piximi tiene como objetivo llevar el análisis de imágenes basado en deep learning a una comunidad más amplia mediante la eliminación de las barreras de entrada.

Funciones básicas: Anotador, Segmentador, Clasificador, Mediciones.

Objetivo del ejercicio

En este ejercicio, se familiarizarás con las principales funcionalidades de Piximi de anotación, segmentación, clasificación, medición y visualización y las utilizarás para analizar un conjunto de imágenes de muestra de un experimento de translocación. El objetivo de este experimento es determinar la dosis efectiva más baja de Wortmannin requerida para inducir la localización nuclear de FOXO1A etiquetada con GFP (Figura 31). Segmentarás las imágenes utilizando uno de los modelos de deep learning disponibles en Piximi. Comprobarás y curarás la segmentación y luego entrenarás un clasificador de imágenes para clasificar las células individuales como según presenten GFP nuclear, GFP citoplasmática o sin GFP. Por último, realizarás mediciones y las representarás gráficamente para responder a la pregunta biológica.

Contexto del experimento de ejemplo

En este experimento, los investigadores tomaron imágenes de células U2OS de osteosarcoma (cáncer de hueso) fijadas que expresaban una proteína de fusión FOXO1A-GFP y tiñeron con DAPI para marcar los núcleos. FOXO1A es un factor de transcripción que desempeña un papel clave en la regulación de la gluconeogénesis y la glicogenólisis a través de la señalización de insulina. FOXO1A se desplaza dinámicamente entre el citoplasma y el núcleo en respuesta a diversos estímulos. Wortmannin, un inhibidor de PI3K, puede bloquear la exportación nuclear, lo que resulta en la acumulación de FOXO1A en el núcleo.

Representación esquemática del mecanismo de acción de FOXO1A.

Materiales necesarios para este ejercicio

No es necesario descargar nada: las imágenes están incluidas en Piximi como un proyecto de ejemplo llamado Translocation Tutorial. Dicho proyecto ontiene todas las imágenes, ya etiquetadas con el tratamiento correspondiente (concentración de Wortmannin o Control).

Instrucciones para el ejercicio

Lee los pasos que se indican a continuación y sigue las instrucciones donde se indican. Los pasos en los que debes averiguar una solución están marcados con 🔴 PARA HACER.

1. Cargar el proyecto Piximi

🔴 PARA HACER

• Inicia Piximi en:https://piximi.app/

• Carga el proyecto de ejemplo: En la pantalla de inicio, haga clic en Open Example Project y selecciona Translocation Tutorial. Si ya tienes un proyecto abierto, puedes llegar a la misma lista a través de Open > Project > Load Example. Opcionalmente puedes cambiar el nombre del proyecto en el panel superior izquierdo, como Ejercicio Piximi. A medida que se carga el proyecto, se puede ver la progresión en la esquina superior izquierda logotipo .

Cargando el proyecto de ejemplo Translocation Tutorial.

2. Comprueba las imágenes cargadas y explore la interfaz Piximi

Visualización de las imágenes del proyecto.

Estas 17 imágenes representan tratamientos con Wortmannin a diez concentraciones diferentes (expresadas en nM), así como tratamientos con sólo vehículo (0 nM). Observe que el canal DAPI (Núcleos) se muestra en magenta y que el canal GFP (FOXOA1) se muestra en verde.

Las etiquetas de color en la esquina superior izquierda de cada imagen, y la lista Categories de la izquierda, proceden de los metadatos guardados con el proyecto de ejemplo. En este tutorial, las etiquetas de diferentes colores indican la concentración de Wortmannin, mientras que los números de la lista representan el número de imágenes en cada categoría.

Opcionalmente, puede etiquetar las imágenes manualmente haciendo clic en el icono + (New Category) junto a Categories e introduciendo un nombre, y luego seleccionando imágenes en la cuadrícula y haciendo clic en el icono Categorize situado encima para asignar una categoría. En este tutorial, nos saltaremos este paso ya que las etiquetas ya forman parte del proyecto. Puedes encontrar más información en la sección Visor de proyectos de los documentos.

3. Segmentar Células - diferenciar las células del background.

🔴 PARA HACER

• Para iniciar la predicción en todas las imágenes, haz clic en el icono Select all situado encima de las imágenes.

Seleccionando todas las imágenes.

• En la sección Learning Task, cambie la tarea a Segmentation.

Cambiando la tarea a Segmentation.

• Haz clic en Select Model y aparecerá la ventana Load Segmentation Model, que te permite elegir un modelo pre-entrenado.

La ventana Load Segmentation Model.

• Para el ejercicio de hoy, selecciona Cellpose-SAM de la lista Pre-trained Models. Puedes encontrar más información sobre los modelos admitidos aquí. Haz clic en Load Model para cargar su modelo y seleccionarlo. El modelo se ejecuta en tu navegador, por lo que la primera vez descarga los archivos del modelo (Cellpose-SAM ocupa unos 588 MB y requiere un navegador compatible con WebGPU).

Eligiendo Cellpose-SAM de la lista Pre-trained Models.

• Por último, haz clic en Run Segmentation. Los objetos segmentados se añadirán al proyecto como un nuevo tipo (kind), con el nombre indicado en Output kind name (cellpose_cells por defecto). Piximi muestra el progreso de la segmentación mientras se ejecuta.

Ejecutando la segmentación.

Ten en cuenta que los pasos anteriores se realizaron en tu computadora local, lo que significa que tus imágenes se almacenan localmente. La inferencia de Cellpose-SAM también se ejecuta localmente en tu navegador, por lo que tus imágenes nunca se cargan.

4. Visualiza el resultado de la segmentación y corrije los errores de segmentación

🔴 PARA HACER

• Haz clic en Annotations encima de la cuadrícula de imágenes y luego en la pestaña cellpose_cells para comprobar las células individuales que se han segmentado.

Visualización del tipo cellpose_cells.

• Selecciona algunos objetos identificados o imágenes completas, luego haz clic en Image Viewer en la barra superior para verlos en el Visor de Imágenes.

Visualización de las células segmentadas en el Visor de Imágenes.

• Opcionalmente, aquí puedes refinar manualmente la segmentación utilizando las herramientas del anotador. El anotador de Piximi ofrece varias opciones para añadir, restar o interseccionar anotaciones. Además, la herramienta de selección te permite redimensionar o eliminar anotaciones específicas. Para empezar a editar, selecciona imágenes específicas, o todas las imágenes, haciendo clic en la casilla de verificación de la parte superior.

• Opcionalmente, puedes ajustar los canales: Aunque hay dos canales en este experimento, la señal de los núcleos se duplicó en los canales rojo y verde. Este diseño está pensado para ser accesible a daltonismo (color-blind friendly) y para producir un color magenta para los núcleos. El canal verde también incluye señales citoplasmáticas.

Otra razón para duplicar los canales es que algunos modelos (como Cellpose que usamos hoy) requieren que las imágenes de entrada tengan tres canales.

• Puedes optar por segmentar manualmente las células para generar máscaras para la ‘verdad de referencia’ (ground truth).

5. Clasificar células

Razón para hacer esto: Queremos clasificar las “cellpose_cells” basándonos en la distribución de la GFP (en Núcleos, citoplasma, o sin GFP) sin etiquetarlas todas y cada una manualmente. Para ello, podemos utilizar la función de clasificación en Piximi, que nos permite entrenar un clasificador utilizando un pequeño subconjunto de datos etiquetados y luego clasificar automáticamente las células restantes.

🔴 PARA HACER

• Ir a la pestaña cellpose_cells (en la vista Annotations) que muestra los objetos segmentados, y hacer clic en el botón Classification de la sección Learning Task del panel izquierdo. Las categorías que aparecen a la izquierda pertenecen ahora a las células y no a las imágenes.

La sección de clasificación del panel izquierdo.

• Crea nuevas categorías haciendo clic en el icono + (New Category) junto a Categories, introduciendo un nombre en la ventana Create Category y haciendo clic en Confirm. Añadir tres categorías: GFP_Cytoplasmatico, GFP_Nucleae, Sin_GFP.

Creando una categoría.

• Haz clic en las células que coincidan con sus criterios; cada clic añade una célula a la selección (utiliza el icono Deselect para empezar de nuevo). Intenta asignar ~20-40 células por categoría. Una vez seleccionadas, haz clic en el icono Categorize situado encima de las células y elige la categoría para asignarla a las células seleccionadas.

Clasificando células individuales en base a la presencia de GFP y su localización.

6. Entrenar el modelo clasificador

🔴 PARA HACER

• Haz clic en Fit en la sección Learning Task para abrir la ventana Fit Model con la configuración del modelo (pestaña Hyperparameters). Para el ejercicio de hoy, ajustaremos algunos parámetros:

• Comprueba que la Model Architecture esté establecida en Simple CNN (el valor por defecto).

• En Data Preprocessing Settings > Image Augmentation, actualiza el Input Shape a:

  • Row: 48

  • Col: 48

  • Ch.: 3 (ya que nuestras imágenes están en formato RGB)

  (Puedes cambiar a otros números como 64, 128)

• En la sección Data Partitioning, establece el Training Percentage (porcentaje de entrenamiento) en 0,75, que reserva el 25% de los datos etiquetados para la validación.

Configuración del modelo clasificador.

• Cuando hagas clic en Fit Classifier en Piximi, la ventana cambia a la pestaña Training Plots, donde aparecen dos gráficos de entrenamiento “Precisión por Epoch” y “Pérdida por Epoch”. Cada gráfico muestra curvas para datos de entrenamiento y validación.

Gráficos del historial de entrenamiento.

• En el gráfico de precisión, verás lo bien que está aprendiendo el modelo. Lo ideal es que tanto la precisión de entrenamiento como la de validación aumenten y se mantengan cercanas.

• En el gráfico de pérdida, los valores más bajos significan un mejor rendimiento. Si la pérdida de validación empieza a aumentar mientras la pérdida de entrenamiento sigue cayendo, el modelo podría estar sobreajustándose.

Estos gráficos le ayudan a comprender cómo está aprendiendo el modelo y si es necesario realizar ajustes. Cierra la ventana Fit Model con el icono de su esquina superior derecha cuando hayas terminado.

7. Evaluar el modelo:

🔴 PARA HACER

• Haz clic en Evaluate para evaluar el modelo que acabamos de entrenar. La matriz de confusión y las métricas de evaluación comparan las predicciones del modelo sobre las células de validación con sus etiquetas de verdad de referencia (ground truth).

Evaluación de la ejecución de entrenamiento.

• Haz clic en Predict para aplicar el modelo que acabamos de entrenar. Este paso generará predicciones en las células que no hemos categorizado.

Predecir clasificador.

• Puedes revisar las predicciones en la pestaña cellpose_cells. Las categorías predichas solo se muestran, no se aplican, hasta que las aceptes, y Clear Predictions las descarta.

• Opcionalmente, puedes seguir categorizando células para refinar la verdad de referencia (ground truth) y mejorar el clasificador, y luego volver a entrenar y predecir. Este proceso es parte de la clasificación Human-in-the-loop, donde se corrige iterativamente y entrenar el modelo basado en la entrada humana.

• Haz clic y mantén presionado Accept Predictions (Hold) para asignar las etiquetas predichas a todos los objetos.

Aceptar predicciones.

8. Medición

Una vez que estés satisfecho con la clasificación, procederemos a medir los objetos. El objetivo del ejercicio de hoy es determinar la concentración mínima de Wortmannin necesaria para bloquear la exportación de FOXO1A-GFP desde los núcleos. Para ello, podemos medir la intensidad total de GFP a nivel de imagen o a nivel de objeto. Aquí medimos las imágenes, que tienen la concentración de Wortmannin como categoría.

🔴 PARA HACER

• Haz clic en Measure en la barra superior del Visor de proyectos.

Navegar a Medidas.

• Haz clic en Add Table, mantenga Images como tipo (kind) y haz clic en Confirm. Nota: La preparación de los datos para la medición puede tardar un tiempo.

Crear tabla de medidas Images.

• En el panel izquierdo, despliega Intensity > Total y marca Channel-1 para seleccionar la medición para GFP. Verás la medición en la tabla de datos.

• En Split Options, arrastra Category desde Available Dimensions hasta Column Grouping para mostrar las mediciones de cada categoría (aquí, cada concentración de Wortmannin). La tabla muestra Count, Mean, Median y Std Dev de cada medición, y el conjunto de datos completo está disponible al exportar el archivo .csv.

Medidas calculadas.

9. Visualización

Después de generar las mediciones, puedes graficar las mediciones.

🔴 PARA HACER

• Haz clic en Plot View encima de la tabla para visualizar las mediciones.

Tabla de mediciones.

• Establece Plot en “Swarm” y elije el Color Theme que prefieras.

• Selecciona Y-axis como “total-Channel-1” y establece “SwarmGroup” como “category”; esto mostrará cómo varía la intensidad de GFP a través de diferentes categorías.

• Seleccionando Show Statistics se superpondrán diagramas de caja sobre los enjambres (swarms), mostrando la mediana, los cuartiles superior e inferior, y el mínimo y el máximo de cada categoría.

• Opcionalmente, puedes experimentar con diferentes tipos de gráficos y ejes para ver si los datos revelan información adicional.

Gráfico de enjambre (swarm) de la intensidad total de GFP por categoría.

10. Exportar los resultados y guardar el proyecto

🔴 PARA HACER

• Haz clic en Save en la esquina superior izquierda para guardar todo el proyecto. Verás la animación del logo de Piximi a medida que avanza el guardado .

11. Información adicional

Consulta el paper de Piximi: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.06.03.597232v2

Consulta la documentación de Piximi:Documentación de Piximi:https://documentation.piximi.app/intro.html

Informar de fallos/errores o solicitar características piximi/documentation#issues